Pour en savoir plus sur la production des antiobiotiques
Pour en savoir plus sur la production des antiobiotiques
Les performances d’une culture en vue de la production industrielle d’antibiotique tiennent dans la capacité d’atteindre les 3 objectifs majeurs (capacité technologique) :
L’inoculum est l’ensemble de la biomasse nécessaire pour ensemencer un fermenteur de production de grande capacité. Sa préparation est basée sur la mise en culture de souches génétiquement modifiées, il convient donc de bien conserver les souches et de bien les propager.
De nombreux organismes producteurs d’antibiotiques sont généralement très instables par exemple : Les Streptomyces présentent un taux de mutation de 0.1 à 1%.
Les techniques utilisées doivent permettre des conservations stables à longue terme, sans multiplication cellulaire.
a)1- Conservation des cellules végétatives :
Les procédés de lyophilisation à -70°c à -196°c permettent de conserver des échantillons dont la durée de vie peut excéder plusieurs années. Les techniques impliquant d’importants refroidissements ou un vide poussé induisent une forte mortalité. Pour limiter ces effets, l’utilisation de cryoprotecteurs tel que le lait écrémé, le glycérol ou le diméthylsulfoxyde est recommandée.
Pratiquement, il faut partir d’une culture en milieu liquide en phase exponentielle de croissance, y ajouter une solution stérile du cryoprotecteurs (10 à 20% en volume). La suspension homogénéisée est répartie dans des récipients identiques utilisés pour la congélation ou la lyophilisation.
a)2- Conservation sous forme de spores :
La plupart des souches utilisées peuvent sporulées sur milieu solide adéquat. Les spores et le mycélium peuvent être décrichés de la gélose par une solution stérile d’eau physiologique. La suspension est filtrée sur coton cardé pour éliminer le mycelium, additionnées de cryoprotecteurs, puis répartie dans plusieurs flacons et traitée de la même façon que les cellules végétatives.
La propagation consiste en une série de cultures appelée « pré culture » dans des milieux de volume croissant. Outre, l’objectif de croissance rapide et la production de biomasse importante, un des buts de la propagation est d’amener les cellules dans un état physiologique propice à une bonne production d’antibiotique pendant ces phases. Pour ce placement physiologique, on effectue une succession de pré cultures ayant lieu dans des milieux différents, convergeant progréssivement vers la composition de milieu de production.
Les procédés de production font appel au mode de culture discontinu ou au mode semi-continu.
Le milieu de production doit d’abord permettre d’assurer une importante croissance pour conduire à une concentration élevée en cellule au moment de la production.
Il doit assurer ensuite la maintenance de la vitalité des cellules et la production optimisée de l’antibiotique. Il doit de ce fait fournir des sources d’énergie et assurer les conditions physico-chimiques désirées (pH, T°, oxygénation).
Les milieux doivent permettre de fournir sans limitation les précurseurs nécessaires aux synthèses des antibiotiques tout en évitant ces phénomènes de répression et/ou d'inhibition.
Les oses, les polyholosides, les acides gras, les triglycérides et les protides fournissent les sources de carbone et d’énergie. Lors de la phase de croissance initiale, il est possible d’ajouter des sources d’énergie rapidement catabolisables assurant une croissance rapide, par exemple: glucose, mais il faudra veiller à ce que ce substrat soit totalement utilisé avant la phase de production pour éviter les phénomènes de répression catabolique de production. Pendant cette phase, les cellules utilisent des sources d’énergie et de carbone lentement catabolisables (lactose par exemple, pour la production de la pénicilline ; dextrine ou amidon pour la production de Macrolides).
Les acides gras et leurs dérivés sont souvent apportés par les huiles sous forme de triglycérides. Les huiles les plus utilisées sont : les huiles de soja, d’arachide, de mais et de colza.
Outre leur rôle de source d’énergie et de précurseurs éventuels, les acides gras exercent des actions physico-chimiques appropriées : formation d’émulsion, réduction des mousses, modification de la perméabilité membranaire. L’ammonium est la meilleure source d’azote pour assurer une croissance rapide. Comme pour le glucose, on ajoute des sels d’ammonium pour favoriser cette phase tout en surveillant la concentration pour éviter la baisse de production liée à une concentration trop élevée. Si l’on choisit de poursuivre l’alimentation par des sels d’ammonium, ils seront apportés en mode semi-continu, généralement l’azote pour la production (2ème phase) sera apporté sous forme de sources complexes ; exemple : farines de soja ou d’arachide riches en protéines ; l’addition de ces éléments s’accompagne du contrôle de l’oxygénation.
Ces sources complexes remplissent de multiples fonctions ex : si les farines de soja servent de source d’azote, elles apportent en même temps des acides nucléiques, des vitamines, des oligo-éléments, des lipides du soufre et du phosphore. La formulation d’un milieu de culture optimal pour la production n’est pas simple, en s’appuyant sur des critères physiologiques et économiques la formulation d’un milieu de production fera appel à une procédure d’optimisation mettant en œuvre une planification expérimentale. La stérilité des milieux de pré culture et de production est un impératif absolu dans ce type de fermentation.
A l’issus de la fermentation, l’antibiotique est présent à des concentrations relativement faibles dans un mélange polyphasique complexe comprenant les cellules, les éléments du milieu et de nombreux métabolites.
Les étapes d’extraction et de purification représentent une part importante devant la diversité des organismes producteurs, des milieux de production et des propriétés physicochimiques des antibiotiques, il est impossible de définir un protocole standard d’extraction et de purification après chaque étape, il convient de quantifier l’antibiotique et de terminer son activité pour apprécier le rendement de l’étape et de la dégradation du produit.
Cette étape de séparation par décantation, filtration ou surtout centrifugation n’est pas obligatoire, mais elle est souvent pratiquée, une quantité élevée d’antibiotique est associée aux cellules d’autant plus que sa concentration est élevée ainsi l’antibiotique pourra être extrait des fractions liquides et solides obtenues.
A partir de la culture, s’il n’ya pas eu de séparation préalable des phases solide-liquide, une extraction par un solvant approprié est effectuée après traitement par un acide ou une base afin d’obtenir une forme ionique de l’antibiotique. Le solvant est choisi pour :
Pour l’extraction liquide –liquide, le solvant ne doit pas être miscible à l’eau, cette étape est donc difficilement applicable à des molécules très hydrophiles. Dans ce cas il peut être préférable d’envisager directement les étapes de purification.
Elle fait appel à des techniques plus raffinées que pour l’extraction de façon à éliminer spécifiquement les impuretés en jouant sur leurs propriétés comparées à celles de l’antibiotique.
Cette étape représente une part importante du cout de production, pour cette raison, le degré de pureté recherché dépendra de l’application.
Pour des applications de type vétérinaire ou lorsque les propriétés de l’antibiotique s’y prennent on peut recourir à nouveau l’extraction liquide-liquide en utilisant différents solvants et en jouant sur le pH initial des solutions, les couts sont relativement modérés lorsque cette méthode ne peut pas être employée ,la purification peut se faire à l’aide de procédés à membrane de type ultra ou nanofiltration ou de gel filtration.
Ces procédés permettent de sélectionner ou d’éliminer certaines molécules présentes dans le mélange à partir d’une dimension-seuil exprimé le plus souvent en diamètre de particules.
Si la purification ne peut pas être obtenue par les techniques précédentes, il faut recourir aux séparations chromatographiques. Ces méthodes conduisent à des degrés de pureté compatible avec les utilisations médicales, mais les étapes de chromatographie sont coûteuses
Les facteurs influençant sur la production des antibiotiques :
La composition du milieu peut régulée la production en réprimant les gènes de biosynthèse des enzymes du métabolisme secondaire et/ou en inhibant leur activité.
Les milieux doivent permettre de fournir sans limitation les précurseurs nécessaires aux synthèses des antibiotiques tout en évitant ces phénomènes de répression et/ou d'inhibition.
1/- Régulation catabolique par la source carbonée:
Pour la plupart des microorganismes producteurs d’antibiotiques, une source de carbone rapidement assimilable tel que le glucose exerce une action négative sur la biosynthèse de ceux-ci. Par contre des sources d'énergie lentement catabolisable tels que l'amidon, les dextrines, faisant intervenir des amylases exo cellulaires sont favorables.
2/-Régulation par les acides gras:
Les acides gras jouent un rôle intéressant. Ils sont présents dans les huiles et peuvent être ajoutés sous forme pure. L’addition d’oléate de méthyle (1%) dans le milieu producteur améliore de plus de 700% la production de la nigéricine. Cette action peut s’expliquer par une modification de perméabilité et par solubilisation intra et extracellulaire de cette antibiotique hydrophobe.
Dans la synthèse des macrolipides par exemple, les enzymes du métabolisme secondaire utilisent les acétyles coenzyme A comme précurseurs du cycle lactonique.
3/- Régulation par la source azotée:
Les fortes concentrations des milieux en ammonium ou en composées azotées rapidement métabolisées suppriment la biosynthèse de nombreux antibiotiques. Les ions ammonium imposent un taux de croissance élevé réprimant les gènes de biosynthèse de nombreuses enzymes impliquées dans la dégradation des acides aminés, inhibent certaines de leurs activités. Lors des phases de production, les ions ammonium doivent être
à concentration limitant ou remplacés par des sources d'azote lentement métabolisées.
4/- Régulation par le phosphate:
La synthèse de nombreuses familles d’antibiotique est supprimée en présence de fortes concentrations en phosphate, celui-ci réprime directement la biosynthèse des enzymes du métabolisme secondaire.
5/-Les oligoéléments:
Toutes une série d’éléments traces, cofacteurs de la croissance des organismes sont nécessaires à des concentrations très faibles (environ 10-7) (Mn, Fe,Co,Ni,Cu,Zn,Mo). Certains jouent un rôle important, quantitativement et qualitativement, dans la biosynthèse des antibiotiques. Le Mn, Fe, Zn sont les ions métalliques les plus importants pour la production des antibiotiques.
Les conditions de culture:
1 /-PH:
Le PH joue un rôle primordial dans la production des métabolites secondaires. De faibles variations de PH peuvent avoir des effets marqués sur la productivité de la souche.
2/-La température:
Si la plage de température permettant une croissance des microorganismes est de l’ordre de 25°C celle permettant une synthèse d’antibiotiques n’est que de 5 à 10°C. les températures optimales pour la production sont situées dans des zones souvent étroites et les optima souvent plus bas que pour la croissance.
3/-L’aération :
Toutes les productions des antibiotiques se déroulent dans les conditions aérobies. Comme pour les facteurs environnementaux, les optima de concentration en oxygène ne sont pas nécessairement les mêmes pour la croissance et pour la synthèse des métabolites secondaires par exemple la production de céphalosporine augmente alors que celle de la pénicilline N diminue si la concentration en oxygène est élevée.
Amélioration par modification des souches :
Les stratégies d’améliorations visent à accroitre la concentration finale en produit, à réduire
la production des co-métabolites indésirables. Pour l’amélioration, ils sont utilisés: la mutagénèse aléatoire et le génie métabolique.
Cette technique ne nécessite pas de connaissance préalable ni de génome ni de la physiologie des souches traitées.
La mutagénèse induit des modifications génétiques au sein de génome sans la localisation de ces derniers puisse à priori être connues, l’un des exemples les plus significatifs de l’apport de cette méthode est l’amélioration de la production de la pénicilline passée progressivement de quelque mg à 40mg par litre.
L’introduction des mutations au sein du génome des micro-organismes se réalise par action des agents mutagènes de nature physique ou chimique dont l’action sur le génome diffère; exemple : rayonnement UV, γ, X
N-methyl-N-nitro-Nnitrosoguanidine
Lorsqu’une mutagénèse est envisagée, il est nécessaire d’établir la concentration, le temps d’exposition ainsi que les conditions de traitement à utiliser qui permettent d’obtenir la plus forte proportion du type de mutant recherchés parmi les cellules et ayant survécu à la mutagenèse.
Dans ce cas, une grande proportion de cellules pourra être éliminée en plaçant les cellules mutagenisées dans un milieu minimal (milieu dans lequel les cellules auxotrophes ne pourront pas se développer) en présence d’antibiotique déterminant uniquement les cellules en croissance donc les non auxotrophes. Les antibiotiques permettent cette sélection sera une pénicilline dans le cas des bactéries, la nystatine dans le cas des champignons.
C’est l’amélioration des potentialités d’une cellule par la manipulation de fonctions enzymatiques bien ciblées, grâce à l’emploie de la technologie de l’ADN recombiné, il repose sur une connaissance précise des fonctions cellulaires à modifiée, ainsi que des gènes qui leur sont associés pour pouvoir réaliser des manipulation de gènes de structure du métabolisme primaire et des manipulations des gènes de régulation.
La première étape consiste à identifier la ou les étapes enzymatiques à modifier pour espérer atteindre le but recherché.
Pour la production d’antibiotique, les cibles sont les suivantes :
I : Intermédiaire.
P : Précurseurs issus du métabolisme Iaire.
A : Antibiotique.
D : produit de dégradation.
Il est possible d’accroître le titre intracellulaire des précurseurs de l’antibiotique issu du métabolisme primaire et ce en :
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Document modifié le
20 mai, 2010
